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細(xì)胞株分離的方法有多種，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的細(xì)胞株。

（1）純化法

在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的（100 mg組織加入1ml ）。

在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒有活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

移棄組織碎片中的，在37℃孵育包含殘留的組織碎片20到30分鐘。

在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆抑制劑。

通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過濾，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）膠原酶純化法

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

（3）Dispase純化法

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。

加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的）

在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

通過離心在中清洗懸液幾次。

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

分離細(xì)胞后，首ci傳代需要注意的問題：

傳代培養(yǎng)時(shí)先觀察細(xì)胞的活性。

細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%，密度控制在80%左右

對于無血清培養(yǎng)基，需要降低使用量。

（1） 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

（2）使用不包含有鈣鎂的或EDTA清洗細(xì)胞。在培養(yǎng)瓶背著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液。

（3）加入消化，消化細(xì)胞與細(xì)胞，操作手法，試劑的效價(jià)有密切的關(guān)系，消化時(shí)應(yīng)注意觀察細(xì)胞形態(tài)，如細(xì)胞變得橢圓透亮，并且可以觀察到細(xì)胞與細(xì)胞間的間隙時(shí)，輕拍瓶身可以看見成流沙狀，即可中止消化，消化時(shí)盡量減少對細(xì)胞的吹打。

（4）當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí)，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基中止消化，計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

（5）對于無血清培養(yǎng)基，加入大豆抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml抑制劑到中將抑制活性。

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